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    【后天或者元旦完结】


    ?有很多研究发发现昼夜节律相关因子的失调与 NSCLC 的复发和转移有关，因此识别出昼夜节律相关因子也是目前临床所需要的。该研究发现，HLF在早期复发的 NSCLC 组织中显著降低，与 NSCLC 患者的早期进展与远处转移显著相关。并且上调 HLF 可抑制肺定植，而沉默 HLF可促进体内 NSCLC 细胞向骨、肝和脑的转移。


    ?机制：下调 HLF 促进非锚定的 NSCLC 细胞在低营养条件下的无氧代谢，通过PPARα和PPARγ转运、激活NF-κB/p65信号通路，基因的缺失和甲基化均有助于下调 NSCLC 组织中的 HLF 的表达。HLF有可能成为临床干预 NSCLC 的新靶点。


    ?虽然多种治疗策略对原发性非小细胞肺癌的治疗具有良好的前景，但由于其早期复发和广泛的转移潜力，非小细胞肺癌仍然是癌症相关死亡的主要原因。


    ?从名字上说，昼夜节律相关分子由一系列的时钟基因和蛋白质组成，在睡眠周期的调节中发挥着重要作用。越来越多的研究报道，昼夜节律相关调节因子的失调通过不同的机制与肿瘤的发生和转移有关。近年来，生物钟基因在 NSCLC 中的作用得到了广泛的关注。例如，在肺腺癌中，过表达CRY2、BMAL1 和 RORA 联合下调 TIMELESS 和 NPAS2 的表达与预后良好相关，而DEC1和 TIMELESS 高表达预示着在鳞状细胞NSCLC中较差的总生存率。


    ?通过分析来自癌症基因组图谱(TCGA)的 NSCLC 数据集中的多个昼夜相关调控因子和我们之前来自Array表达(AE-meta)的整合 RNA 表达谱，在目前的研究中，我们辨认出了一个昼夜基因——肝白血病因子(HLF)，它是脯氨酸和富含酸性氨基酸的碱性亮氨酸拉链转录因子家族(PARbZIP)的成员，在早期复发的NSCLC组织中显著减少，这与 NSCLC 患者的早期进展和远处转移显著相关。


    ?来自 TCGA 的 NSCLC RNA测序数据集，我们发现与相邻正常组织(ANT)相比，NSCLC 组织中 HLF 的表达水平显著降低。通过分析来自 TCGA 的 NSCLC 数据集，与非复发的 NSCLC 组织3年内未复发，n=72）相比，HLF 也是早期复发的 NSCLC 组织（一年内复发，n=72）中所有昼夜节律相关调节下调因子之一。


    ?我们之前基于 AffymetrixU133 Plus2.0芯片(AE-meta)结合TCGA分析的 NSCLC 整合数据谱的结果进一步表明，NSCLC 组织中 HLF 的表达显著下调，并且在早期复发的 NSCLC 组织中进一步减少（补充图A，B）。


    图片? Real-time PCR 和 Western 印迹分析显示，与匹配的ANT相比，7/10对 NSCLC 组织中 HLF 的 mRNA 和蛋白水平降低(图1C和D）。


    ? Western blot 分析配对 NSCLC 组织中 HLF 蛋白水平与配对 ANT 的比较。α-微管蛋白作为负载控制。


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    ? 1年复发 NSCLC 组织(n = 5)与3年非复发 NSCLC 组织(n =5)的HLF mRNA 表达和蛋白水平。转录水平归一化为 GAPDH 表达， Plt;0.05。


    ?此外，与非复发 NSCLC 组织相比，早期复发 NSCLC 组织中 HLF 表达显著下调（图1E，F）。


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    ?不同亚型 NSCLC 及良性肺疾病组织中 HLF 免疫组化染色的典型图片（图A）。恶性NSCLC组织和良性肺组织中 HLF 不同免疫组化染色指数的病例数(良性肺组织，n=64;ADC， n= 204;SQC， n=112;非小细胞肺癌其他亚型，n=26)（图B）。与TCGA(ANT)(ANT、=109、ADC、=511、SQC、=502)相比，ADC 和 SQC 中 HLF 表达下调（图C）。来自TCGA和AE-meta的 NSCLC 数据集证明了这一点（D，E）


    ? Kaplan-Meier生存分析进一步显示，与高 HLF 表达的 NSCLC 患者相比，低 HLF 表达的NSCLC 患者的无进展生存期更差(图2F)，这与TCGA、AE-meta 和 K-MPlotter 分析结果一致(图2G-I)。


    ?同样，在低 HLF 表达的 ADC 和 SQC 患者中观察到较短的无进展生存期(图2J-Q)。


    以上结果说明，低表达HLF与NSCLC的晚期临床病理特征和早期进展相关。


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    ?此外，HLF 的表达水平随着临床分级和阶段（补充图1G–I）的提高而逐渐下降(补充图1E，F）。


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    ?我们首先将 NSCLC 患者分为I级至III级和I级至IV级的不同亚组，如补充图2A-F所示，在相同病理分级下，低表达 HLF 的 NSCLC 患者的无进展生存期较高表达 HLF 的患者短。相应的，根据多个独立数据集，包括我们的样本(补充图2G和H)，TCGA（补充图2I和J），AE-Meta(补充图2K和L)和K-M Plotter(补充图2M?O)，在相同临床阶段的 NSCLC 患者中也有类似的发现。


    ?综上所述，我们的研究结果表明，低表达 HLF 与 NSCLC 患者的早期进展和晚期临床病理特征显著正相关。


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    ?进一步研究发现，在 NSCLC 患者中，HLF 下调与较短的局部无复发生存期和远处无转移生存期呈正相关(补充图3A-D)。同样，低表达 HLF 的 ADC 患者以及 SQC 患者(补充图3I-L)的局部无复发生存期和远处无转移生存期较差(补充图3E-H)。以上结果说明，低表达HLF促进NSCLC早期局部复发和多器官远处转移。


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    ?为了进一步确定 HLF 在 NSCLC 细胞局部肺定植和远处转移中的作用，首先在多个不同亚型的 NSCLC 细胞株中检测了 HLF 的表达。


    ?如补充图4A和B所示，与非癌永生化肺支气管上皮细胞 BEAS-2B 和正常肺成纤维细胞 WI-38相比，NSCLC 细胞中 HLF 的 mRNA 和蛋白质水平差异下调。我们进一步构建了 HLF 过表达的 NCI-H1975(H1975)和 NCI-H520(H520)肺癌细胞，这些细胞表达所有 NSCLC 细胞系中HLF水平最低，并内源性下调 NCI-H460(H460)和 NCI-H1299(H1299)细胞 HLF 的表达，这两种细胞均表达最高的内源性 HLF 水平(补充图4C和D）。


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    ?采用小鼠尾静脉模型研究NSCLC细胞的肺定植和生长能力。如图3A-D和补充图4E，上调 HLF 显著抑制 H1975 细胞在肺中的肿瘤发生，表现为肺结节的形成减少，每m㎡的癌细胞数量减少，累积生存率延长。相反，沉默 HLF 对 H460 细胞有相反的效果(图3A-C、E和补充图4E)。


    ?值得注意的是，HLF 表达的改变不仅影响大肺结节的形成(在分析的肿瘤切片中定义为gt;50肿瘤细胞)(图3B)，但也影响小肺结节的形成(在分析的肿瘤切片中定义为5-50个肿瘤细胞)(补充图4E)，这支持了 HLF 在肿瘤细胞的早期定植和随后的肺内生长中都起着重要作用的观点。


    ?最后，与实验结束时相比，在注射 HLF 稳定过表达的 H1975 细胞和下调 H460 细胞的小鼠肿瘤组织中，进一步证实了相应的高和低表达水平(补充图4F)。


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    ?然后，采用体内左心室接种小鼠模型检测 HLF 对 NSCLC 远处转移能力的影响，将载体/NCI-H1975、HLF 过表达 NCI-H1975、载体/NCI-H460 和 HLFsh#1/NCI-H460 细胞接种到小鼠左心室。


    ?接种细胞6周后，收集小鼠的胫骨、脑、肝组织，并进行 Hamp;E 染色处理。如图所示。图3F-I和补充图4G，我们在与载体组相比，过 HLF 表达小鼠组中，包括骨、大脑和肝脏等远处器官检测到较少的转移性肿瘤，以及较长的累积存活期延长。


    ?相比之下，沉默HLF可显著增强骨、脑和肝脏转移瘤的形成，并缩短生存期(图3F-I和补充图4H)。


    ?因此，这些结果表明，低表达 HLF 的 NSCLC 细胞具有更强的局部定植和生长能力，以及更强的远处转移能力。


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    ?我们利用CCK-8、集落形成和An连接素凋亡进一步研究了 HLF 在 NSCLC 中的生物学功能，发现在正常培养条件下，HLF 对 NSCLC 细胞的增殖和凋亡能力没有显著影响(补充图5A–C)。


    ?我们的结果显示，上调 HLF 会增加培养液的PH水平，而沉默 HLF 会降低培养基的pH水平，但正常情况下 HLF 并不影响 NSCLC 细胞的表型和数量(补充图5D)。


    ?低表达 HLF 可能通过营养代谢途径促进 NSCLC 细胞对低营养状态的适应，因为即使在正常的含氧条件下，癌细胞也更倾向于通过厌氧途径代谢。


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    ?然而，上调 HLF 抑制 NSCLC 的生长，而沉默 HLF 可促进 NSCLC 细胞的锚定和悬浮生长能力(图4A和B)，表明沉默 HLF 增强了 NSCLC 细胞在悬浮条件下的生存能力，即 anoikis 耐药。这是各种癌症中与远处转移有关的转移性癌细胞的主要特征。


    ?事实上，昼夜节律基因的失调导致了 NSCLC 的代谢失调，HLF 广泛参与了多种物质代谢过程，包括脂质和氧化代谢。


    ?在低血清(1%)和低葡萄糖(1g/L)培养液组成的低营养条件下，HLF 过表达抑制了


    NSCLC 细胞的增殖，但增加了凋亡潜能，反之亦然（图4C-E）。


    ? HLF 参与了癌细胞生长培养基的营养代谢，这是 HLF 抑制 NSCLC 细胞生长的前提条件。


    ?在低营养条件下观察 NSCLC 细胞 HLF 对葡萄糖、脂肪酸和蛋白质的影响。如补充图6A，HLF 表达的改变并不影响总蛋白含量。然而，HLF 的上调降低了葡萄糖、甘油三酯的消耗和乳酸的分泌，但增加了游离脂肪酸的水平(图4F–I)。


    ?矛盾的是，上调 HLF 增加了细胞内 ATP 的总产生和 LDH 的活性(补充图6B和C）。这些发现表明，在低营养条件下，过表达 HLF 的癌细胞更容易发生有氧代谢而不是厌氧代谢，这进一步支持了上调 HLF 降低乳酸脱氢酶(LDH)的活性，厌氧糖酵解限速酶，一些厌氧糖酵解和乳酸发酵相关基因，但增强了多个三羧酸循环相关基因(。


    ?相反，沉默 HLF 则表现出相反的代谢特性，促进了 NSCLC 细胞的厌氧代谢(图4F-I和补充图6C和D)。上诉结果表明，低表达HLF促进非小细胞肺癌细胞的厌氧代谢。


    ?事实上，即使在氧含量正常的情况下，癌细胞也表现出葡萄糖代谢特征的改变，更倾向于无氧代谢，这一现象被称为“瓦伯格效应”。综上所述，我们的结果表明，低表达 HLF 可促进 NSCLC 细胞从三羧酸循环向厌氧代谢的首选代谢途径的转换，从而进一步促进细胞在低营养条件下的生长。


    ?为了进一步确定低营养条件下 HLF 抑制 NSCLC 生长和转移的潜在机制，我们将多个信号通路的荧光素酶报告质粒转染到NSCLC细胞中。如图5A所示，上调 HLF 显著增强了 NSCLC 细胞 PPAR 信号活性，抑制了NF-κB信号活性;相反，沉默 HLF 则产生相反的效果(图5A)。


    ?基于 TCGA 的 NSCLC 数据集中 HLF 的表达进行了基因集富集分析(GSEA)，结果显示 HLF的表达水平与 PPAR 信号呈正相关，而与 NF-κB 信号呈负相关。根据 GSEA 分析，HLF 表达与脂质氧化和糖酵解显著相关(补充图6F)。


    ?重要的是，一些证据表明，HLF 通过增加脂解诱导的游离脂肪酸积累，参与 PPAR 的易位和激活，通过破坏 p65 与靶 DNA 的结合，NF-κB 信号通路广泛参与了癌症的进展和转移。PPAR 信号通路由 PPARα、PPARβ/δ和 PPARγ等几个家族成员组成。因此，确定参与 HLF 抑制 NF-κB 信号通路以及 NSCLC 肿瘤发生和转移的特异性 PPAR 成员至关重要。


    ?首先，检测10对 NSCLC 组织中PPARα、PPARβ/δ和 PPARγ的表达水平。如补充图6G和H，PPARα在4/10对组织中表达显著下调，PPARγ在8/10对表达，而PPARβ/δ在8/10对组织中表达上调。已有广泛报道称 PPARα和 PPARγ在 NSCLC 中起肿瘤抑制信号的作用，而据报道 PPARβ/δ对起致癌作用。


    ? Western blot 分析一致显示，HLF 的上调增加了 PPARα和 PPARγ的总表达和核易位，增加了IκBα的表达，但降低了磷酸化的 NF-κB 和 p65 的总水平和核水平。相反，沉默 HLF 则发挥了相反的作用。因此，我们的研究结果表明，HLF 在 NSCLC 中激活 PPARα和 PPARγ，抑制 NF-κB/p65 信号通路。


    ?我们使用 PPARα激动剂非诺贝特、PPARγ激动剂吡格列酮和 NF-κB 信号抑制剂LY2409881，进一步研究了 PPARα/PPARγ/NF-κB/p65 信号轴在 HLF 在 NSCLC 细胞中的功能作用中的意义。


    ?我们的结果显示，在 HLF 沉默的细胞中，非诺贝特和吡格列酮显著上调了 PPAR 的活性，而 LY2409881 则没有上。


    ?然而，非诺贝特、吡格列酮和 LY2409881 差异降低了 HLF 沉默细胞中 NF-κB 信号的活性。


    ?重要的是，非诺贝特、吡格列酮和 LY2409881 减弱了 HLF 下调对细胞非锚定生长和抗缺氧能力的刺激作用。相反，非诺贝特、吡格列酮和 LY2409881 逆转了低营养条件下HLF下调对 NSCLC 细胞的促增殖（克隆生长）和抗凋亡作用